DNA部分片段的连接
DNA部分片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5′末端浓度为0.1-1.0 μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′和 5′末端都保留完整,连接反应才会发生;而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′和 5′末端都是完整的,而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。
人工酶与限制酶的区别是什么?
生物体内的天然酶都是由几百个氨基酸分子组成的蛋白质。酶所以有那么强的催化作用,跟它特有的结构有关。酶有一个活化中心,即它的催化基因。在化学反应中,催化基因处在两个底物小分子中间,把两个小分子紧紧地拉在周围,使它们结合起来。这就好比一个大人的两只手拉住两个小孩使他们亲近。酶的这种作用能大大加速生物化学反应。
在细菌内存在的一类能识别并水解外源DNA限制性内切酶,它具有很好的专一性,能识别DNA上的特定位点,将DNA的两条链都切断,形成黏性末端或平末端。DNA经限制酶切割后产生的具有碱基互补单链的末端称为黏性末端。限制酶的生物学功能在于降解外面侵入的DNA而不降解自身细胞中的DNA,因自身DNA的酶切位点经修饰酶的甲1基化修饰而受到保护。限制酶较为稳定,常用的约100多种并已转化为商品。限制酶在分析染色体结构、制作DNA的限制酶图谱、测定较长DNA序列以及基因的分离、基因的体外重组等研究中是不可缺少的重要工具酶。
一般是以微生物属名的第yi个字母和种名的前两个字母组成,第四个字母表示菌株(品系)。例如,从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H,在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶,可以编成不同的号,如HindⅡ、HindⅢ,内切酶,HpaI、HpaⅡ,MboI、MboⅡ等。
别名:restriction endonuclease简称限制酶
酶反应:限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义:在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA,保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的,迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。
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