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DNA部分片段的连接
DNA部分片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5′末端浓度为0.1-1.0 μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生;而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′和 5′末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第yi型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第yi型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition)可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第yi型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfIII。
限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。
质粒DNA的相对分子量(Mr )一般在106～107 范围内，如质粒pBR的相对分子质量为2.8×106 ，在细胞内有三种构型：①共价闭环DNA，内切酶，常以超螺旋形式存在;②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA;③双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断，不能成环，完全开放成线状，简称线性DNA。如果要测定质粒DNA的相对分子量，建议把质粒用单一切口的酶水解得到线性DNA部分片段。三种构型的质粒DNA 在电泳时的泳动速度为：共价闭环DNA>线状DNA >开环DNA。
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