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水稻原位杂交检测技术服务-科锐诺生物

询盘留言 |投诉|申领|删除 产品编号:584821018                    更新时间:2024-09-12
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.杂交 (1) 盛有2×SSC的塑料盘同,将干烤的滤膜飘浮在液面上,浸湿5分钟。(2) 将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。(3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。(4) 将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃,而在50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2小时。(5) 将32 P标记的双链DNA探针于100℃加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间,盛滤膜的容器应盖严,以防液体蒸发。

原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已 成为有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

阻断内源性过氧化物酶:滴加3%1甲1醇-H2O2,室温避光孵育15min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

预杂交:滴加预杂交液,37°C孵育1h。

杂交:倾去预杂交液,滴加含探针has-circ-ST6GALNAC6 probe 杂交液,浓度6ng/ul,水稻原位杂交检测技术服务,恒温箱37度杂交过夜。

杂交后洗涤:洗去杂交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多,可以增加甲酰胺洗涤。

滴加封闭液:滴加封闭血1清(正常兔血1清),室温30min。

滴加鼠抗地1高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP):倾去封闭液,滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min,后PBS洗3次×5min。

        

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