原位杂交的应用范围:
①细胞特异性mRNA转录的定位,可用于基因图谱,基因表达和基因组进化的研究;
②感1染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位,如EB病毒mRNA、人类乳1头状瘤1病毒和巨细胞病毒DNA的检测;
③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测;
④基因在染色体上的定位;
⑤检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等;
⑥分裂间期细胞遗传学的研究,如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定,某些肿1瘤的诊断和生物学剂量测定等。
目前,我国已稳定开展的分子病理技术主要有显色原位杂交、荧光原位杂交、PCR、荧光定量PCR、基因芯片和DNA测序技术。显色原位杂交(chromogenicinsituhybridization,CISH)技术是分子生物学、组织化学及细胞学相结合产生的一门新兴技术,是利用核酸分子单链间碱基互补的原理,将地1高辛或生物素标记的外源核酸探针与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对,结合成双链杂交分子,通过过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。根据探针种类不同可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交。滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗。
.滴加生物素化鼠抗地1高辛:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
.苏1木素复染,植物原位杂交服务公司,充分水洗。
酒精脱水,二甲1苯透明,封片。
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