亚细胞定位操作步骤
1、通过一些在线网站预测亚细胞定位
2、亚细胞定位载体构建
(1)引物设计:利用引物设计软件,湖北亚细胞定位,根据pEGP-MCS-N1或pEGP-C1-MCS的酶切位点设计目的基因引物。
(2)载体构建:将PCR产物酶切后插入pEGP-MCS-N1或pEF-C1-MCS,得到表达目的基因与EGP融合蛋白质的真核表达载体。
3、细胞转染
当细胞生长到对数生长期时,洋葱亚细胞定位,接种到共聚焦显微镜的玻璃底培养皿(35mm petri dish,10 mm Microwell)中,培养过夜。当细胞贴壁率达到30%~50%时,将融合绿色荧光蛋白GFP的重组载体质粒和目标细胞器质粒共转染细胞。37℃孵箱培养24~72h。
4、激光扫描共聚焦显微镜观察
将上述细胞分别在24、36、48、72h的时间点,根据实验需求选择对应激发波长(常用405nm、488nm和561nm),使用共聚焦显微镜观察,亚细胞定位服务,采取图像。
为什么有的基因定位结果与预想的不一致?
对于一个特定的定位载体,只要荧光表达较好,其定位结果是确定的,不会随人为意愿或操作而改变。至于有时候和预想的结果不一样,可能和蛋白本身、选择的表达载体以及荧光蛋白融合方式等有关。
为什么有的普通定位结果出来后无法准确判断其定位位置?
细胞中的细胞器复杂且多样,除一些常见的、特征比较明显的细胞器外,有些细胞器在激光共聚焦下形状比较相似,例如:线粒体、过氧化物酶体、高尔基体等细胞器,它们的荧光表达形状可能都是点状,因此不易区分。这时可以结合基因的其他功能研究来判断其可能表达的位置。另外,蛋白表达本身也是一个复杂的过程,涉及到多个合成场所及转运过程,自身表达情况可能比较复杂,因此不易判断具体的表达位置。
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